點擊數：67942017-02-14 14:30:12 來源: 邢臺思倍特生物科技有限公司,枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,堿性蛋白酶,中性蛋白酶,中溫α-淀粉酶
導 讀
隨著經濟的快速發展，我國面臨著土壤鎘（Cd）污染日益嚴重的問題。利用微生物修復土壤Cd污染具有效果好、成本低等優點，受到人們越來越多的關注。而芽孢桿菌環境適應性強，具有高效吸附Cd能力，在修復土壤Cd污染上有一定的潛力，因此深入研究芽孢桿菌對土壤Cd污染修復具有重要的意義。
文章綜述了我國土壤Cd污染現狀及芽孢桿菌在修復重金屬Cd污染的應用，分析了其修復土壤Cd污染的作用機制，并對芽孢桿菌修復土壤重金屬Cd污染的存在問題進行展望。
來源：《廣東農業科學》2016年第1期
背 景
隨著工業快速發展以及人類活動逐漸加強，土壤重金屬污染的問題也日益嚴重，其中土壤Cd污染范圍最廣、污染程度最嚴重。由2014年的全國土壤污染狀況調查公報可知，我國耕地土壤污染點位超標率為19.4%，且以無機污染物，特別是重金屬污染為主。其中重金屬Cd點位超標率達到7.0%，是重金屬污染物中點位超標率最高的。據統計，每年我國有2000萬hm2以上的耕地受鎘（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、鉻（Cr）、鉛（Pb）等重金屬污染，受到污染的糧食產量高達1200萬t，造成經濟損失超過200億元。Cd是耕地及工業園區、礦區周圍土壤重金屬污染的最主要來源。表1是部分礦區周圍耕地和農作物中的Cd含量狀況，從表1可以看出，這部分地區的耕地Cd含量都遠遠超出該地Cd背景值，且農作物可食部分Cd含量也大部分超過《食品中污染物限量》（GB2762-2012）中規定的食品中Cd含量的限定值，說明這些地區的Cd污染程度相當嚴重。鑒于我國土壤Cd污染日趨嚴重，開展修復工作已經刻不容緩。
目前，重金屬污染修復方法有物理修復法（客土法、電動修復法、電熱修復法）、化學修復法（土壤淋洗法、化學固定技術）和生物修復法（植物修復法、動物修復法和微生物修復法）。物理修復法和化學修復法修復效果好，但是成本高，易造成二次污染，不適于大面積土壤重金屬修復。而微生物修復法具有成本低、污染少等優點，再加上國家政策傾斜，使其成為重金屬污染土壤修復的重要方向。
常用于土壤重金屬修復的菌株有菌根真菌、假單胞菌、光合細菌、芽孢桿菌、酵母菌等，其中芽孢桿菌（Bacillus）因具有較高的環境兼容性，且對重金屬Cd具有較好的吸附效果，在土壤重金屬Cd污染修復上具有較大的研究價值。本文就其應用及作用機制進行總結，以期為芽孢桿菌用于重金屬污染修復提供理論依據。
1 芽孢桿菌在土壤Cd污染修復的應用
大多數芽孢桿菌屬為革蘭氏陽性菌，在缺乏營養或不良環境時能產生芽孢。常見用于土壤修復劑的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌（Bacillus. subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）等。許多研究發現芽孢桿菌對重金屬離子吸附效果明顯。表2是幾種芽孢桿菌對重金屬Cd2+的吸附水平，從表2可以看出，芽孢桿菌對水相中重金屬Cd的吸附率比較高，可將其應用到重金屬廢水、重金屬污染土壤的修復中。
1.1
降低土壤有效態Cd和植物Cd積累
土壤有效態Cd含量變化取決于土壤Cd不同形態的比例分配。土壤Cd總量越高，有效態Cd的比例越高，植物體內Cd含量也就越高。一些芽孢桿菌不僅可以直接吸附土壤Cd2+，還可以通過影響土壤理化性質來降低土壤有效態Cd含量，從而降低土壤Cd對植物的毒性。
枯草芽孢桿菌是土壤中廣泛分布的一種需氧型細菌，在防治作物病蟲病害、修復重金屬污染方面起到重要作用。紀宏偉等研究發現枯草芽孢桿菌可以使土壤有效態Cd含量降低5.07%～42.63%，且培養時間越長，鈍化效果越顯著。范仲學等通過盆栽試驗表明，施用2g/kg的枯草芽孢桿菌對緩解花生Cd脅迫的效果最好，可使籽粒中Cd含量降低25.37%。Jiang CX 等以枯草芽孢桿菌為出發菌株進行誘變，篩選出一株高抗Cd的誘變菌B38，該菌和諾沃肥復合對Cd污染（10mg/kg）的土壤進行修復后，胡蘿卜地下部Cd含量下降至0.15mg/kg，土壤中可提取態Cd的含量降低了73.9%。
蠟狀芽孢桿菌對Cd、Pb、Cr等重金屬具有較強的抗性，可通過靜電吸附、離子交換作用、表面絡合作用吸附水相中重金屬。但蠟狀芽孢桿菌用于土壤重金屬修復的實例相關報道還不多見。胡永娟利用蠟狀芽孢桿菌修復麥田Cr，結果表明小麥幼苗葉和根系Cr含量分別下降8.87%～24.67% ；當蠟狀芽孢桿菌與米根霉聯用時，可使小麥地上部和地下部Cr含量分別降低42.15%～46.91% 和26.11%～48.24%，土壤有效態Cr含量下降2.1%～9.0%，說明蠟狀芽孢桿菌在修復土壤重金屬污染方面的應用是具備一定潛力的。目前有關蠟狀芽孢桿菌對土壤Cd的修復的實例還比較少，但由于蠟狀芽孢桿菌對Cd具有極強的抗性，且對Cd的吸附效果好，使其在土壤Cd污染修復方面的應用具有較大的研究價值。
1.2
強化植物修復土壤Cd污染
微生物-植物聯合修復是目前常見的土壤重金屬污染修復方法之一，微生物能夠改善土壤環境，解決土壤中重金屬的生物有效性較低而限制植物修復發展的問題。有研究表明，某些芽孢桿菌接種于土壤后，能促進植物生長，提高土壤有效Cd含量，很大程度上提高植物修復效率。
巨大芽孢桿菌、膠質芽胞桿菌具有解磷、解鉀的功能，能促進植物生長，在代謝過程中可產生有機酸，對土壤重金屬有一定溶解活化作用。王小敏等研究表明，不同Cd污染水平下巨大芽孢桿菌可使土壤中有效態Cd含量提高3.8%~24.4%；將其與印度芥菜聯合修復土壤Cd污染，可使印度芥菜Cd含量提高13.9%~96.9% ，印度芥菜地上部Cd含量最高增加42.1%，土壤中可交換態Cd含量最高增加10.7%。楊榕等考察了不同接種量條件下膠質芽孢桿菌對印度芥菜修復Cd污染土壤的影響，結果表明，不同濃度的膠質芽孢桿菌可使土壤Cd含量降低4.7%~20.9%，同時能提高根際土壤有效態Cd含量15.15%~36.54%，非根際土壤有效態Cd含量提高31.73%~45.28%。
2 芽孢桿菌修復Cd污染土壤的作用機制
2.1
胞外吸附
芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁中含有大量肽聚糖和磷壁酸，因此能夠提供大量的羧基、酰胺基等活性基團，這些基團可以失去質子而使菌體表面帶有較強負電荷，使之能靠靜電引力吸附重金屬離子。例如，在蠟狀芽孢桿菌吸附Cd飽和平衡后，pH 值的升高或降低會改變菌體吸附Cd的解吸率以及細菌表面所帶電荷，說明靜電吸附對蠟狀芽孢桿菌吸附重金屬Cd起到一定作用。同時，在細胞吸附重金屬離子過程中，細胞壁會與重金屬離子進行離子交換，置換出其他陽離子。在蠟狀芽孢桿菌吸附Cd后，上清液中K+、Na+、Mg2+和Ca2+離子含量增加，說明發生了離子交換作用。
重金屬陽離子與分子或帶有自由電子的陰離子能夠發生絡合、螯合作用。芽孢桿菌表面帶有大量的陰離子活性基團，如-OH、-COOH能吸附重金屬離子形成重金屬配合物，降低遷移率。劉紅娟等篩選到一株對Cd具有較高抗性和富集能力的蠟狀芽孢桿菌，通過紅外光譜分析發現，蠟狀芽孢桿菌細胞壁上活性基團-OH、-NH-、-COOH、-PO43- 和-M-O（O-M-O）（M 為金屬離子）與重金屬Cd2+的絡合密切相關。孫靜等通過考察地衣芽孢桿菌富集鎘的特性及機理，發現地衣芽孢桿菌對Cd2+的吸附以表面吸附為主，細胞壁上的羧基、羰基、酰胺基含有大量孤對電子，能成為Cd2+的電子供體，發生絡合作用，從而實現對Cd的富集。
吸附在芽孢桿菌表面的Cd離子能夠與可溶性或不可溶性的生物多聚物發生螯合作用，形成Cd（OH）2、Cd3（PO4）2、CdS、CdCO3等沉淀，使重金屬固定。孫靜等通過掃描電鏡觀察Cd脅迫下的地衣芽孢桿菌發現，地衣芽孢桿菌細胞壁存在大量含Cd2+的顆粒。劉紅娟等發現，在Cd濃度為150mg/L的條件下，蠟狀芽孢桿菌的細胞壁和菌體表面有大量Cd沉淀物存在，無Cd條件下則沒有。芽孢桿菌在含高濃度Cd的液體培養基中培養時能在細胞表面形成沉淀或吸附Cd沉淀，從而富集重金屬Cd。
2.2
胞內積累
芽孢桿菌胞外吸附重金屬Cd離子，再通過依賴能量的轉移系統將Cd運送到細胞內，可能通過外排作用或在細胞內形成沉淀來降低重金屬Cd對細胞的毒害。Surowitz 等研究了枯草芽孢桿菌1A1原生質體對Cd2+離子的吸附，發現Cd2+離子的積累與細胞代謝有關，當存在抑制劑氰化鉀時，枯草芽孢桿菌原生質體對Cd2+離子的吸附能力遠遠降低，表明枯草芽孢桿菌1A1可以通過主動運輸的方式將Cd2+離子運送至細胞內。此外，Cd2+可被作為Mg2+、Zn2+等結構類似物通過離子通道運到細胞內。有研究人員通過透鏡電鏡觀察高濃度（1000mg/L）Cd條件下培養的地衣芽孢桿菌，發現菌體表面凹凸不平，細胞壁上和細胞內含有大量大小為50nm左右的Cd沉淀顆粒。
有研究表明，幾乎所有微生物細胞內的蛋白質、多肽等大分子對重金屬都有很強的結合能力。利用圓二色光譜分析不同濃度Cd脅迫下菌體蛋白質分子二級結構的變化，結果發現高濃度Cd脅迫下地衣芽孢桿菌的蛋白質空間構象發生了變化。
芽孢桿菌吸附富集Cd的過程可能受到基因調控，相關研究認為蠟狀芽孢桿菌的抗Cd基因是由質?？刂频?，經過消除質粒處理的蠟狀芽孢桿菌對高濃度（200mg/L）Cd不具有抗性。而Solovieva 等對枯草芽孢桿菌的抗Cd性能研究發現，Cd2+能夠誘導一個位于染色體上2.2kb CadA的轉錄，該基因在枯草芽孢桿菌上是Cd2+ 抗性染色體決定子。微生物吸附重金屬的機制十分復雜，不同微生物吸附機理也不單一，其具體機理還有待進一步研究。
目前，微生物吸附重金屬的研究大多側重于細胞的表面吸附機制，而細胞內代謝活動對Cd吸附影響的研究較少。芽孢桿菌胞內Cd的積累有利于環境中Cd的去除，但過量Cd會抑制菌體活性，因此尋求耐Cd能力較高的菌株仍是研究人員不斷努力的目標。
2.3
胞外聚合物促進Cd吸附
微生物在一定條件下能分泌高分子聚合物（如蛋白質、多糖、核酸等），這些生物大分子即細菌胞外聚合物（EPS），對重金屬有很強的吸附能力。Fang 等認為細菌結合態EPS官能團類型與枯草芽孢桿菌表面活性基團類型一致，EPS存在能明顯提高菌體表面活性基團濃度?？莶菅挎邨U菌EPS能通過絡合、離子交換、沉淀等方式提高枯草芽孢桿菌對重金屬離子的吸附作用，去除EPS后的枯草芽孢桿菌對Cd2+的吸附量下降51.4%。EPS的存在還能增強細菌的粘附強度，促使細菌快速吸附于土壤礦物顆粒上。Huang等研究表明，將細菌接種到土壤中，土壤膠體表面積增加3.0%～8.8%，表面所帶負電荷增加，促進對Cd的吸附。
2.4
小分子有機酸提高Cd的生物有效性
微生物通過各種代謝活動產生多種低分子量的有機酸（如甲酸、乙酸、丙酸、檸檬酸等），能影響土壤中重金屬沉淀-溶解平衡，從而改變重金屬在土壤中存在形態的分布。楊卓等利用反向高效液相色譜測定巨大芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌發酵液中的有機酸成分，發現在發酵過程中巨大芽孢桿菌和膠質芽孢桿菌能產生檸草酸、檬酸、蘋果酸等有機酸，而這些有機酸能改變土壤Cd存在形態，提高土壤中Cd的生物有效性。芽孢桿菌通過代謝活動產生的有機酸能活化土壤重金屬Cd，影響植物對Cd的吸收，可用于微生物強化植物修復土壤重金屬Cd污染的研究。
2.5
改變土壤理化性質
芽孢桿菌不僅可以直接吸附重金屬離子，還可以通過影響土壤理化性質（包括土壤pH、陽離子交換量、有機質含量、氧化還原電位、土壤微生物等）來改變重金屬在土壤中不同形態的分布。楊榕等研究發現膠質芽孢桿菌能分泌有機酸，降低植物根際土壤pH，從而提高土壤有效態Cd的含量，進一步證實了土壤有效態Cd與土壤pH呈負相關。膠質芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的解磷、解鉀作用能增加土壤中的陽離子交換量，而陽離子交換量越高，說明土壤膠體的負電荷量越高，通過靜電吸附的Cd2+就越多。
2.6
結語
芽孢桿菌對土壤Cd的修復機理見圖1，由圖1可知，芽孢桿菌對Cd的修復包括：（1）Cd2+通過靜電吸附作用被吸附到細胞表面，與表面活性基團發生絡合作用形成金屬絡合物；（2）Cd2+與芽孢桿菌表面的Ca2+、K+等陽離子發生離子交換；（3）細胞表面沉淀或吸附沉淀有利于Cd2+的穩定化；（4）芽孢桿菌通過主動運輸積累Cd2+；（5）代謝分泌物作用，EPS對Cd2+的吸附作用以及有機酸對Cd沉淀的溶解活化作用 。
3 問題與展望
芽孢桿菌對Cd、Pb、Cr等重金屬有較強的吸附作用，且在改善土壤理化性質和降低土壤重金屬含量方面表現出積極效果，在Cd、Pb、Cr等重金屬污染土壤修復的發展前景十分廣闊。然而，芽孢桿菌在修復土壤重金屬污染方面的應用還處于初級階段，仍需從以下幾個方面進行深入研究：
（1）利用基因工程、細胞工程等生物技術手段提高芽孢桿菌對Cd的耐受性和吸收性，對具有修復能力的菌株進行優化培養，使之達到最優的生物修復效果。
（2）芽孢桿菌修復重金屬Cd污染的作用機制比較復雜，需要進一步研究芽孢桿菌與土壤礦物顆粒、植物分泌物的相互影響，以改善修復效果。
（3）巨大芽孢桿菌和膠質芽孢桿菌等能活化土壤重金屬Cd，增加Cd在土壤中的轉移性，容易引起土壤和水體的二次污染。應深入研究修復劑施用方法，最大程度地提高芽孢桿菌輔助植物修復土壤Cd污染的效率。
（4）目前芽孢桿菌修復土壤Cd污染的研究多數是在實驗室或小規模田間進行，在推廣應用前，應結合大田試驗。
